超高速原子力顯微鏡HS-AFM+質量光度計觀察粘連蛋白介導DNA環擠出

超高速視頻級原子力顯微鏡（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）由日本 Kanazawa 大學 Prof. Ando 教授團隊研發，日本RIBM公司（生體分子計測研究所株式會社，Research Institute of Biomolecule Metrology Co., Ltd）商業化的產品，可以達到視頻級成像的商業化原子力顯微鏡。HS-AFM突破了傳統原子力顯微鏡“掃描成像速慢"的限制，能夠在液體環境下超快速動態成像，分辨率為納米水平。樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動態觀測。超高速視頻級原子力顯微鏡HS-AFM主要有兩種型號，SS-NEX樣品掃描（Sample-Scanning HS-AFM）以及PS-NEX探針掃描（Probe-Scanning HS-AFM）。推出至今，已有150多位用戶，發表 SCI 文章 300 余篇，包括Science, Nature, Cell 等雜志。

相較于目前市場上的原子力顯微鏡成像設備，HS-AFM突破了 “掃描成像速慢"的限制，掃描速度高可達 20 frame/s，并且有 4 種掃描臺可供選擇。樣品無需特殊固定染色，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動態觀測。液體環境下直接檢測，超快速動態成像，分辨率為納米水平。探針小，適用于生物樣品；懸臂探針共振頻率高，彈簧系數小，避免了對生物樣品等的損傷。懸臂探針可自動漂移校準，適用于長時間觀測。采用動態PID控制，高速掃描時仍可獲得清晰的圖像。XY軸分辨率2nm；Z軸分辨率0.5nm。

HS-AFM不僅擁有超高掃描速率與原子級別分辨率，而且具有操作的簡易性，使得對單分子動態過程的捕捉變得十分方便，為科研工作者研究和理解生物物理、生物化學、分子生物學、病毒學以及生物醫學等領域的單分子動態過程提供了一款強大的工具。全新的HS-AFM采用了新的高頻微懸臂架構，更低噪音、更高穩定性的控制器，高速掃描器，緩沖防震設計，主動阻尼，動態PID，驅動算法優化，多種前沿技術，可以實現在超高速下獲取高分辨的生物樣品信息。新系統整合了基于工作流程的操作軟件，直觀的用戶界面與流程化、自動化的設置使得研究人員可以專注于實驗設計，不需要復雜的操作和條件設置，快速獲取數據，加速研究的產出。

基因組DNA折疊形成環狀以及拓撲關聯結構域（Topologically associating domains，TADs），從而組成了基因組復雜的三維結構，這些三維結構具有重要的結構和調控作用。先前的研究已經逐漸揭示出基因組結構是由染色體結構維持SMC（Structural maintenance of chromosomes）蛋白復合物所介導的環擠出（DNA loop extrusion）過程形成的（圖1）。單分子層面的研究表明SMC蛋白復合體和Cohesin蛋白的確能夠將DNA擠壓形成環狀。因此，關于基因組的三維結構形成研究者們提出了“環擠出假說"，認為染色體結構維持的SMC復合物組織就基因組的拓撲結構，并通過環擠出來實現這一功能。但是這一過程的具體細節是如何進行的還不得而知。

奧地利維也納生物中心 (VBC)分子病理學研究所Jan-Michael Peters研究組發現粘連蛋白通過“擺動和鉗夾"機制介導 DNA 環擠出。2021年10月7日出版的《細胞》雜志發表了這一成果。作者分析了人類粘連蛋白-NIPBL 復合物如何介導環擠出，并使間期細胞中的染色質折疊。 他們已經確定了環擠出所需的 DNA 結合位點和大規模構象變化，并確定了這些是如何協調的。他們的結果表明 DNA 通過自發的 50 nm 擺動的粘連蛋白鉸鏈轉移，將 DNA 交給 SMC3 的 ATPase 頭部，在那里結合 ATP，然后DNA 被 NIPBL 夾住。

在這個過程中，NIPBL 從鉸鏈“跳躍"到 SMC3 頭部，從而可能將自發鉸鏈擺動與 ATP 依賴性 DNA 夾緊結合起來。 這些結果揭示了粘連蛋白-NIPBL 和可能的其他染色體結構維持 (SMC)復合物如何介導環擠出的機械原理。

該實驗過程通過借助日本RIBM公司研發的超高速視頻原子力顯微鏡HS-AFM來完成，HS-AFM突破了傳統原子力顯微鏡“掃描成像速慢"的限制，能夠實現在液體環境下超快速動態成像，分辨率為納米水平。待測樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動態觀測。

目前，一些體外的生化重構實驗一定程度上已經證實了環擠出假說，這些結果證明SMC蛋白與Cohesin蛋白會以2.1kb/s的速度擠壓DNA，并且這一過程依賴于ATP酶活性（圖2）。但限于實驗分辨率等問題，環擠出的過程是如何實現的具體細節還不得而知。

DNA環擠出過程中具體的構象變化是如何發生的呢？為了揭開這一過程的全貌，作者們應用了高速原子力顯微鏡（High-speed atomic force microscopy，HS-AFM）對Cohesin進行了實時成像。

在ATP存在的情況下的，Cohesin三聚體復合物中會在環狀、桿狀以及彎曲狀構象之間的變化。作者們發現DNA是通過Cohesin蛋白鉸鏈的彎曲進而易位的，這樣將DNA轉移到SMC3的ATP酶活性頭部，在該位置與ATP結合，DNA被NIPBL夾住。在此過程中NIPBL從鉸鏈向SMC3頭部移動，引發鉸鏈區域的自發擺動以及ATP依賴的DNA結合，從而形成一個循環，使得DNA從鉸鏈延伸到SMC3的頭部，在此循環周期的末尾，DNA片段可以轉移到SMC1的頭部。由此，作者們提出了DNA環擠出的“擺-夾"“Swing and clamp"模型，這類似于抓娃娃機的小爪子，可以將通過鉸鏈的彎曲伸出機械手“抓住"DNA，然后上提，從而通過一次次循環促使DNA逐步環擠出。

結果：

（1）：人黏連蛋白由四個亞基組成：SMC1，SMC3，Scc1和STAG1。SMC1和SMC3通過它們的鉸鏈結構域異二聚化。SMC1-SMC3鉸鏈異二聚體與STAG1的“ U"的底部直接接觸，DNA首先由NIPBL和STAG1募集到處于SMC1和SMC3頭部結構域分離狀態的黏連蛋白，ATP結合后，Scc1連接SMC1和SMC3的ATPase頭部結構域形成環，并將DNA捕獲在SMC隔室內。然后，NIPBL和STAG1包裹在DNA周圍，形成中ZHONG央通道并進一步包裹DNA。

（2）：通過TwoMP質量光度法（單分子質量光度計分析系統）證實了SMC1和SMC3頭部結構域（SMC1HD、SMC3HD）可以各自結合單個DNA分子作為單體：在存在ATP的前提下，對SMC1HD和SMC3HD含和不含40堿基對（bp）雙鏈（ds）DNA進行質量光度分析,負質量對應于蛋白質-DNA復合物在兩幀之間從表面解離的事件。

（3）：冷凍電鏡Cryo-EM在不同的構象中觀察到了黏連蛋白，但尚不清楚哪些在天然條件下存在，以及黏連蛋白如何從一種構象變化到另一種構象。因此，作者通過超高速視頻級原子力顯微鏡HS-AFM實時成像黏連蛋白。為了確定哪些亞基和結構域可以通過HS-AFM可視化，作者分析了在含有SMC1、SMC3和SCC1的三聚體及結合到NIPBL（N）的三聚體，以及含有SMC1、SMC3和SCC1和STAG1（S）的四聚體及結合到NIPBL的四聚體，圖F中顯示了對應于鉸鏈（hi）、頭部（he）、NIPBL（N）和STAG1（S）的密度。

（4）：隨后通過質量光度法測定的二聚體（SMC1、SMC3）和三聚體（SMC1、SMC3和SCC1）的質量分布，可以證實這些復合體中含有SCC1，并且二聚體（286 kDa）和三聚體（399 kDa）的理論質量與測量值非常一致（圖G、H）。質量光度法（Mass Photometry）是一種革命性的分子分析新方法。它能夠準確測量溶液中天然狀態下的單個分子的質量數，無需標記，為生物分析和生物分子功能研究開辟了新的途徑。其原理是：粒子散射的光信號與粒子的體積和折射率成線性關系。由于生物分子的光學性質和密度僅有百分之幾的差別，所以散射信號也就與分子的質量成正比，因此可以用光稱量單個分子。散射信號與質量的相關性適用于各種生物分子（例如糖蛋白、核酸和/或脂質），這使得質量光度法成為溶液中生物分子的通用分析工具。

（5）：在ATP存在下，（SMC1、SMC3和SCC1）三聚體復合物方式上在環狀（rings）、棒狀（rods）和扭曲（bent）構象之間交替出現（圖I）。在環形復合體中，卷曲的線圈被拉伸但彼此分開，而頭部結構域要么相互接觸，代表ATP接合狀態；要么頭部結構域脫離，代表ATP非接合狀態。在桿狀復合體中，頭部結構域脫離，線圈對齊；在許多情況下，相互扭曲（圖I），在這種狀態下，鉸鏈有時會短暫打開。

（6）：（SMC1、SMC3和SCC1）三聚體復合物在接合和脫離狀態之間振蕩，在后一種構造中，可以對齊和彎曲其線圈（圖K，head movement，coil alignment）；當STAG1和NIPBL與三聚體結合時，也觀察到類似的變化；當線圈折疊成彎曲是不對稱狀態時，鉸鏈靠近一個頭部，但不靠近另一個頭部（圖K，hinge bending，鉸鏈彎曲）。

討論：

由染色體結構維持SMC蛋白復合物所介導的DNA環的擠出過程仍然是一個迷，這一過程被認為具有重要的結構和調控功能。作者通過超高速視頻級原子力顯微鏡HS-AFM實時成像技術首SHOU次深入了解了人類粘連蛋白-NIPBL復合物易位DNA以介導DNA環擠出的機制原理，并可能對理解其他SMC復合物如何發揮這一功能具有更廣泛的意義。

作者通過超高速視頻級原子力顯微鏡實時成像，實現了對Cohesin促使的DNA環擠出過程的全紀錄，從而能夠將DNA從一個結合位點帶到另一個結合位點，揭開了SMC復合體進行基因組的折疊的以及促進復雜基因組三維拓撲結構形成的機制。通過質量光度法測定的二聚體（SMC1、SMC3）和三聚體（SMC1、SMC3和SCC1）的質量分布。

參考文獻：

Benedikt W. Bauer, et al. Cohesin mediates DNA loop extrusion by a“swing and clamp"mechanism. Cell 184, 5448–5464, October 14, 2021.

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