超高速原子力顯微鏡HS-AFM+NanoDSF觀察TRPV3通道五聚體
超高速原子力顯微鏡HS-AFM+NanoDSF觀察TRPV3通道五聚體
超高速視頻級原子力顯微鏡（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）由日本 Kanazawa 大學 Prof. Ando 教授團隊研發，日本RIBM公司（生體分子計測研究所株式會社，Research Institute of Biomolecule Metrology Co., Ltd）商業化的產品，可以達到視頻級成像的商業化原子力顯微鏡。HS-AFM突破了傳統原子力顯微鏡“掃描成像速慢"的限制，能夠在液體環境下超快速動態成像，分辨率為納米水平。樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動態觀測。超高速視頻級原子力顯微鏡HS-AFM主要有兩種型號，SS-NEX樣品掃描（Sample-Scanning HS-AFM）以及PS-NEX探針掃描（Probe-Scanning HS-AFM）。推出至今已有150多位用戶，發表 SCI 文章 300 余篇，包括Science, Nature, Cell 等雜志。
相較于目前市場上的原子力顯微鏡成像設備，HS-AFM突破了 “掃描成像速慢"的限制，掃描速度高可達 20 frame/s，并且有 4 種掃描臺可供選擇。樣品無需特殊固定染色，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動態觀測。液體環境下直接檢測，超快速動態成像，分辨率為納米水平。探針小，適用于生物樣品；懸臂探針共振頻率高，彈簧系數小，避免了對生物樣品等的損傷。懸臂探針可自動漂移校準，適用于長時間觀測。采用動態PID控制，高速掃描時仍可獲得清晰的圖像。XY軸分辨率2nm；Z軸分辨率0.5nm。
HS-AFM不僅擁有超高掃描速率與原子級別分辨率，而且具有操作的簡易性，使得對單分子動態過程的捕捉變得十分方便，為科研工作者研究和理解生物物理、生物化學、分子生物學、病毒學以及生物醫學等領域的單分子動態過程提供了一款強大的工具。全新的HS-AFM采用了新的高頻微懸臂架構，更低噪音、更高穩定性的控制器，高速掃描器，緩沖防震設計，主動阻尼，動態PID，驅動算法優化，多種前沿技術，可以實現在超高速下獲取高分辨的生物樣品信息。新系統整合了基于工作流程的操作軟件，直觀的用戶界面與流程化、自動化的設置使得研究人員可以專注于實驗設計，不需要復雜的操作和條件設置，快速獲取數據，加速研究的產出。
目前已經解析了大量的瞬時受體電位通道TRP(transient receptor potential)家族的結構，顯示都是四聚體，但關于TRPV通道的許多方面仍然知之甚少，包括孔膨脹現象（pore-dilation phenomenon）。科學家通過超高速原子力顯微鏡HS-AFM，在單分子水平上分析了膜嵌入的TRPV3，并發現了一種五聚體狀態。并且通過NanoDSF進一步探究了 DPBA對TRPV3四聚體狀態的破壞作用。
基因組DNA折疊形成環狀以及拓撲關聯結構域（Topologically associating domains，TADs），從而組成了基因組復雜的三維結構，這些三維結構具有重要的結構和調控作用。先前的研究已經逐漸揭示出基因組結構是由染色體結構維持SMC（Structural maintenance of chromosomes）蛋白復合物所介導的環擠出（DNA loop extrusion）過程形成的（圖1）。單分子層面的研究表明SMC蛋白復合體和Cohesin蛋白的確能夠將DNA擠壓形成環狀。因此，關于基因組的三維結構形成研究者們提出了“環擠出假說"，認為染色體結構維持的SMC復合物組織就基因組的拓撲結構，并通過環擠出來實現這一功能。但是這一過程的具體細節是如何進行的還不得而知。
瞬時受體電位（TRP）通道是一個龐大的真核離子通道超家族，控制著多種生理功能，因此是具吸引力的藥物靶點。目前已確定了來自 20 多種不同 TRP 通道的 210 多種結構，且均為四聚體。盡管有如此豐富的結構信息，但關于 TRPV 通道的許多方面仍知之甚少，包括孔道擴張現象，即長時間激活會導致電導增加、對大離子的通透性增強以及整流性喪失。在此，我們利用日本RIBM公司的超高速視頻級原子力顯微鏡（HS-AFM，SS-NEX）在單分子水平上分析了嵌入膜的 TRPV3，并發現了一種五聚體狀態。HS-AFM 動態成像顯示，五聚體在與經典四聚體的動態平衡中具有短暫性和可逆性，通過膜擴散亞基交換實現。加入二苯基硼酸酐（DPBA）后，五聚體的群體增加，DPBA 是一種已被證明可誘導 TRPV3 孔道擴張的激動劑。基于這些發現，我們設計了一條蛋白質生產和數據分析流程，最終獲得了 TRPV3 的冷凍電子顯微鏡結構。五聚體，其孔徑比四聚體大。進入和退出五聚體狀態的緩慢動力學、加入 DPBA 后五聚體形成的增加以及孔徑的擴大表明，五聚體代表了孔徑擴張的結構相關性。因此，我們展示了膜擴散原體交換作為結構變化和構象變異性的一種額外機制。總的來說，我們為非典型的五聚體 TRP 通道組裝提供了結構證據，為 TRP 通道研究開辟了新的方向。
結果：
（1）：將蛋白質脂質體沉積在新切割的云母上，并在緩沖溶液中成像，通過HS-AFM視頻，發現在典型四聚體通道旁邊檢測到五聚體TRPV3。
（2）：觀察到29個明確的TRPV3四聚體-五聚體或五聚體-四聚體轉換過程（12 + 11 + 6）,65個只有TRPV3五聚體的狀態。作者在320μM二苯基硼酸酐（DPBA）存在的情況（DPBA是一種配體，之前已被證明可以誘導TRPV3中的孔膨脹）下通過HS-AFM對TRPV3進行了成像。
（3）：為了進一步探究 DPBA 對 TRPV3 四聚體狀態的破壞作用，我們進行了納米差示掃描熒光法（nanoDSF）實驗，并通過監測 350 和/或 330 納米處熒光發射隨溫度的變化來測量 TRPV3 的熱穩定性。在 nanoDSF 實驗中，測量的是蛋白質中色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）的固有熒光，其會因局部環境的變化而改變，例如溫度依賴性的構象變化、寡聚體解離和/或變性。TRPV3 的熱變性曲線顯示出兩個一階導數峰，分別對應兩個熔解溫度，DI YI個熔解溫度（Tm1）表現為反向藍移曲線，在 55.5 ± 0.1°C 處有一個拐點，第二個熔解溫度（Tm2）在 63.4 ± 0.3°C 處有一個拐點（圖 4c，d）。值得注意的是，當向同一蛋白質樣品中加入 320 μM DPBA 時，Tm1 降至 52.7 ± 0.6°C，Tm2 降至 61.3 ± 0.5°C。而當分別加入 32 和 100 μM DPBA 時，這些配體濃度已被證明可誘導典型的盡管激活了電流但并未增強次級電流 25，熔點更接近于無配體狀態，即 Tm1 和 Tm2 分別為 55.1 ± 0.5 和 54.5 ± 0.3 攝氏度以及 63.1 ± 0.3 和 62.6 ± 0.6 攝氏度（圖 4c，d）。最后，當向樣本中加入 1000 μM 的 DPBA（一種已被證實會導致導電性崩潰的配體）時，觀察到穩定性進一步顯著下降，Tm1 和 Tm2 分別為 51.3 ± 1.0 和 60.5 ±0.3°（圖 4c、d）。在 350 納米和 330 納米處的熒光紅移表明內部色氨酸暴露，而熒光藍移則內部色氨酸缺失或在熱變性過程中內部酪氨酸的暴露相關。通過檢查 TRPV3 結構中酪氨酸和色氨酸的分布，我們發現許多內部隱藏的色氨酸和酪氨酸，特別是許多隱藏在亞基界面處的酪氨酸（補充圖 4）。這使我們推測 Tm1 對應于 TRPV3 低聚物的解體，表現為亞基界面處的酪氨酸暴露，而 Tm2 對應于 TRPV3 單體的變性。另一種解釋可能是 Tm1 與溫度感應構象變化有關，而 Tm2 與單體斷裂和變性有關。無論具體事件的順序如何，DPBA 顯然影響了單體界面的完整性并使通道不穩定。因此，這些結果與我們在添加 DPBA 后通過 HS-AFM 觀察到的四聚體減少和 TRPV3 片段增加是一致的。
結果：
HS-AFM
將 2 微升的 TRPV3 重組囊泡液滴置于 1.5 平方毫米的新鮮云母表面，該表面用紫外線膠粘在石英樣品臺上。在濕度室中孵育 5 分鐘后，用成像緩沖液（無配體（apo）條件：20 毫摩爾 Tris-HCl，pH 8.0，150 毫摩爾 NaCl；孔擴張條件：20 毫摩爾 Tris-HCl，pH 8.0，150 毫摩爾 NaCl 和 320 微摩爾 DPBA）輕輕沖洗樣品臺上的樣品，然后將其安裝在 HS-AFM 液體池中。在 150 毫摩爾 NaCl 存在的情況下，一個薄薄的緩沖液層（約 5 埃）將支撐膜與云母基底隔開，使膜蛋白能夠擴散，如本文中 TRPV3 通道在密集膜中的橫向和旋轉運動所顯示的那樣。在室溫下使用 HS-AFM（SS-NEX，日本RIBM公司）以振幅調制模式拍攝圖像，該模式具有優化的掃描和反饋參數，并使用 IgorPro RIBM 軟件（Ibis v.1.1.0，IgorPro v.6.3.7.2）。使用了標稱彈簧常數為 0.15 牛頓/米、共振頻率約為 650 千赫茲、在緩沖液中的品質因數約為 1.5 的超短（8 微米）懸臂（USC-F1.2-k0.15，NanoWorld）。IgorPro v.8（WaveMetrics）用于高掃描速率原子力顯微鏡（HS-AFM）數據采集。采用氧等離子體蝕刻來銳化針尖。HS-AFM 圖像以每秒 0.5 至 3 幀的速度采集，像素采樣率為每像素 1.25 至 8 埃。在非常相似的條件下進行的 HS-AFM 成像已用于分析其他幾種膜蛋白的結構和動態，如 OmpG、AqpZ、ec-CLC、GltPh、CorA、Piezo-1 和 GLIC42，51–57，但從未觀察到像此處記錄的 TRPV3 這樣的寡聚化變化。HS-AFM 視頻對齊、平整化和橫截面分析、高度分布和徑向輪廓分析均在 ImageJ 中完成。
NanoDSF
使用 NanoDSF 技術對在 HEK293S GnTI? 細胞中表達的純化 TRPV3 進行了熱變性曲線測量，所用樣品為從尺寸排阻色譜柱中獲得的對應純四聚體的峰組分，將其稀釋至 3.3 μM 濃度（在 20 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1 mM βME 和 0.01%（w/v）GDN 中）。在無配體條件下以及分別加入 32（n = 6 次生物獨立實驗）、100（n = 6）、320（n = 7）和 1，000 μM（n = 6）DPBA 后進行了測量，使用 Tycho NT.6儀器，按照制造商的說明進行操作。采用單側不等方差（Welch）t 檢驗評估統計學意義，結果表明加入 320 μM DPBA 后，Tm1 和 Tm2 均顯著降低（99%置信水平，P = 0.000038 和 0.00190），而加入 1，000 μM DPBA 后，Tm1 和 Tm2 進一步降低（P = 0.015（95%置信水平）和 0.0043（99%置信水平）。
參考文獻：
Shifra Lansky, John Michael Betancourt, Jingying Zhang, Yining Jiang, Elizabeth D. Kim
A pentameric TRPV3 channel with a dilated pore
206 | Nature | Vol 621 | 7 September 2023
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